Mikroskopia świetlna to dziedzina wykorzystująca urządzenia – mikroskopy do oglądania próbek i obiektów, które są zbyt małe, aby można je było zobaczyć nieuzbrojonym okiem. Wizualizacja obiektu odbywa się za pośrednictwem wiązki światła lub elektronów. Ogólnie, padająca wiązka jest przesyłana ze źródła znajdującego się po przeciwnej stronie próbki/obiektu do soczewki skupiającej, która skupia ją na próbce w celu uzyskania maksymalnej jasności. Po przejściu przez próbkę, wiązka pada na soczewkę obiektywu, która powiększa obraz próbki, a następnie do okularów, gdzie oglądany obraz jest dodatkowo powiększany. W mikroskopii szczególnie ważne są dwa parametry: powiększenie i rozdzielczość.

Mikroskopy wykorzystujące światło widzialne (mikroskopy optyczne) (nie są w stanie rozróżnić szczegółów próbki mniejszych niż 0,2 μm, powiększenie do 1 000 razy) są zwykle mikroskopami jasnego pola, to znaczy, że światło widzialne przechodzące przez próbkę jest wykorzystywane do bezpośredniego tworzenia obrazu, bez żadnych modyfikacji. Innym rodzajem mikroskopii świetlnej jest mikroskopia fluorescencyjna, która służy do obrazowania próbek fluorescencyjnych, tzn. próbek absorbujących jedną długość fali promieniowania elektromagnetycznego i emitujących inną długość fali promieniowania elektromagnetycznego. Na przykład, w mikroskopach konfokalnych fluorescencyjnych światło monochromatyczne emitowane przez laser jest używane do wzbudzania cząsteczek fluorescencyjnych z cienkiej warstwy próbki, a światło o innej długości fali emitowane z tej warstwy tworzy ostry obraz bez interferencji ze strony cząsteczek fluorescencyjnych obecnych w innych warstwach. Ze względu na fakt, iż większość próbek nie jest naturalnym fluorescentem, przed pomiarem próbki zazwyczaj znakuje się barwnikiem lub znacznikiem fluorescencyjnym. Mikroskopy elektronowe różnią się od mikroskopów świetlnych tym, że tworzą obraz próbki za pomocą wiązki elektronów, a nie wiązki światła. Elektrony mają znacznie krótszą długość fali (około 0.1 nm) niż światło widzialne (380 – 780 nm), dzięki czemu mikroskop elektronowy daje obraz o wyższej rozdzielczości niż standardowy mikroskop świetlny. Jedyne ograniczenie mikroskopów elektronowych jest związane z koniecznością umieszczenia próbki pod próżnią. Istnieją trzy główne rodzaje mikroskopii elektronowej: mikroskopia sił atomowych (AFM), transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) [1].

W SEM niskoenergetyczna wiązka elektronów (energia 1 – 30 keV) ogniskowana w wąskiej sondzie przemieszcza się tam i z powrotem po powierzchni próbki, tworząc szczegółowy obraz 3D tej powierzchni (powiększenie 500 000 krotne), co sprawia, iż technika ta jest używana do analizy morfologii powierzchni dowolnej próbki. Wiązka elektronów oddziałuje z próbką w sposób bardzo podobny do kształtu łzy, który jest określany jako objętość oddziaływania. Głębokość tego oddziaływania wynosi od kilku nm do 5.0 μm. W wyniku oddziaływania dochodzi do odbicia wysokoenergetycznych elektronów wstecznie rozproszonych przez rozproszenie elastyczne (tryb obrazowania wstecznego), emisji elektronów wtórnych przez rozproszenie nieelastyczne (tryb obrazowania elektronów wtórnych) i emisji promieniowania elektromagnetycznego (ciągłego). Każdy z tych efektów może być oddzielnie wykrywany przez odpowiednio wyspecjalizowane detektory. Najczęściej stosowanymi mikroskopami SEM są konwencjonalne SEM o wysokiej rozdzielczości (powszechnie stosowane do badań nieorganicznych i twardych nanomateriałów) i SEM środowiskowe (powszechnie stosowane do badań miękkich biomateriałów i polimerów). Środowiskowa skaningowa mikroskopia elektronowa (ESEM) wykorzystuje niskie napięcie przyspieszające (np. 12 kV) i nie wymaga stosowania powłok na powierzchni próbki, które mogą zasłaniać drobną strukturę powierzchni próbki, a próbkę można obserwować w środowisku gazowym przy niskim ciśnieniu (1 – 50 Torr).

TEM wykorzystuje wiązkę elektronów poruszających się szybko ( \( {\lambda} \) = 0.00251 nm (przy 200 kV)) emitowaną przez działo elektronowe, która za pomocą szeregu soczewek elektromagnetycznych jest skupiana na próbce. Na próbce elektrony są absorbowane lub przepuszczane przez próbkę i za pomocą soczewki projekcyjnej tworzą obraz na ekranie fosforyzującym lub detektorze CCD. Oddziaływanie wiązki elektronów z próbką wpływa na kontrast obrazu. Obszar tego oddziaływania zależy od liczby atomowej pierwiastków obecnych w próbce i grubości próbki. To znaczy, pierwiastki o rosnącej liczbie atomowej mają duży przekrój atomowy, a co za tym idzie, wykazują większe prawdopodobieństwo pochłaniania elektronów, co zapewnia większy kontrast przy obrazowaniu próbki. Przed obrazowaniem próbka jest cięta na wyjątkowo cienkie plasterki (1 100 nm), a wiązka elektronów przechodzi przez wycinek, a nie ślizga się po jego powierzchni, dzięki czemu daje obraz o wysokiej rozdzielczości, głębi ostrości i powiększeniu zapewniający dostęp do informacji na temat struktury wewnętrznej próbki (układu atomów w nanoskali; powiększenie nawet 10 000 000 krotne). Pomiary TEM zazwyczaj wykonuje się przy napięciu 80 – 300 kV. Energię dobiera się tak, aby uzyskać jak najlepszą rozdzielczość (długość fali elektronu jest odwrotnie proporcjonalna do energii elektronu, a zatem otrzymuje się wyższą rozdzielczość przy wyższej energii) nie niszcząc próbki. Dlatego w przypadku próbek biologicznych i miękkich polimerów napięcie robocze wynosić około 80 – 100 kV.

AFM to technika wykorzystująca sondę skanującą (SPM), która umożliwia uzyskanie rozdzielczości do ułamków nanometra i dostarcza informacji o powierzchni poprzez dotknięcie sondą powierzchni próbki. Pomiędzy próbką, a końcówką SPM dochodzi do oddziaływań o krótkim i długim zasięgu. W oddziaływaniach bliskiego zasięgu dominują siły van der Waalsa, podczas gdy w oddziaływaniach dalekiego zasięgu dominują siły elektryczne i magnetyczne. Podstawą AFM jest krzywa zależności energii potencjalnej od odległości ( \( {r} \)). Siła wypadkowa pomiędzy dwoma atomami jest wynikiem sił przyciągania ( \( \cfrac{1}{{r}{^2}} \)) i odpychania ( \( \cfrac{1}{{r}{^6}} \)), a nachylenie siły odpychającej dominuje bardziej na krótszych odległościach niż siły przyciągania. W przypadku dwóch atomów znajdujących się w dużej odległości od siebie, siłę wypadkową można zaniedbać. Gdy jeden atom zbliża się do drugiego, dominują siły przyciągania, które osiągają maksimum dla odległości międzyatomowej pomiędzy dwoma atomami. Następnie zaczynają dominować siły odpychające. W zależności od oddziaływania pomiędzy SPM a powierzchnią próbki, krzywa siły i odległości mierzona jest w postaci ugięcia odbitej wiązki lasera z pozycji centralnej.